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    微載體培養(yǎng)原理

    發(fā)布時間: 2011/5/13  點擊次數(shù): 1103次
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    詳細(xì)介紹:

    微載體培養(yǎng)原理
     

     1.原理:

    其原理是將對細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中,作為載體,使細(xì)胞在微載體表面附著生長,同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。

    貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖,要經(jīng)歷黏附貼壁、生長和擴(kuò)展成單層三個階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖,故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否在微載體表面黏附,主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。

    2. 攪拌轉(zhuǎn)速:

    由于動物細(xì)胞無細(xì)胞壁,對剪切力敏感,因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作方式是:在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速,時攪時停;數(shù)小時后,待細(xì)胞附著于微載體表面時,維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速,進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢,zui大速度75r/min。

    3.細(xì)胞與微載體的相融性,是與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理PH值時,表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷,則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷,因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁,但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時,則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。

    4. 細(xì)胞在微載體表面的生長 影響細(xì)胞在微載體表面生長的因素很多,主要有三個方面:

    ●在細(xì)胞方面,如細(xì)胞群體、狀態(tài)和類型。

    ●在微載體方面,如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子;微載體表面光滑時細(xì)胞擴(kuò)展快,表面多孔則擴(kuò)展慢。

    ●在培養(yǎng)環(huán)境中,如培養(yǎng)基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長。如果所處條件*,則細(xì)胞生長快;反之生長速度慢。

    5. 微載體培養(yǎng)操作要點

    ●培養(yǎng)初期:保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的PH與溫度水平,接種細(xì)胞(對數(shù)生長期,而非穩(wěn)定期)至終體積1/3的培養(yǎng)液中,以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量,更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。

    ●貼壁階段(3-8d)后,緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積,并且增加攪拌速度保證*均質(zhì)混合。

    ●培養(yǎng)維持期:進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)(胞核計數(shù))、葡萄糖測定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨意細(xì)胞增殖,微球變得越來越重,需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右,培養(yǎng)液開始呈酸性,需換液:停止攪拌,讓微珠沉淀5min,棄掉適宜體積的培養(yǎng)液,緩慢加入新鮮培養(yǎng)液(37℃),重新開始攪拌。

    ●收獲細(xì)胞:首先排干培養(yǎng)液,至少用緩沖液漂洗1遍,然后加入相應(yīng)的酶,快速攪拌(75-125r/min)20-30min。然后解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。

    ●微載體培養(yǎng)的放大:可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素,已被放大至4000L以上。

     

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